動態(tài)濁度法定量測定人凝血酶原復合物制品中細菌內(nèi)毒素含量

來源：http://www.attrakmagnet.com/ 作者：余氯檢測儀 時間：2018-07-25

　　[目的] 建立動態(tài)濁度法定量測定人凝血酶原復合物制品中細菌內(nèi)毒素含量的方法。

　　[方法] 通過對樣品中定量添加標準內(nèi)毒素的干擾試驗，檢測其回收率應在50%～200%范圍。

　　[結(jié)果] 人凝血酶原復合物制品對鱟試驗無干擾作用，動態(tài)濁度法定量檢測結(jié)果與家兔實驗結(jié)果基本一致。

　　[結(jié)論] 應用本方法定量測定人凝血酶原復合物制品中細菌內(nèi)毒素含量是可行的。

　　關鍵詞： 人凝血酶原復合物; 細菌內(nèi)毒素; 動態(tài)濁度法; 鱟試驗

　　人凝血酶原復合物臨床上主要用于治療先天性和獲得性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏癥[1-2]。依據(jù)2010年版《中國藥典》三部規(guī)定，人凝血酶原復合物制品中熱原檢查是采用家兔法，但此法操作繁瑣，時間長且費用高，不適用于制品的生產(chǎn)過程控制和成品的大規(guī)模熱原檢測，故需建立一種快速測定的方法，用于人凝血酶原復合物生產(chǎn)過程中細菌內(nèi)毒素含量的控制。筆者參閱了有關文獻[3-4]，初步建立了動態(tài)濁度法定量測定人凝血酶原復合物制品中細菌內(nèi)毒素含量的方法。

　　1 材料與方法

　　1.1 樣品和儀器

　　人凝血酶原復合物(批號為20110610、20110711、20110712、20110713、20110714、20110815、20110816、20110919、 Test1、Test2、Test3，規(guī)格為300 IU/瓶);細菌內(nèi)毒素檢查用水(批號為1010130，規(guī)格為5 mL/支，湛江安度斯生物有限公司);動態(tài)濁度法鱟試劑(批號為1010142，規(guī)格為1.25 mL/支，λ=0.03 EU/mL，湛江安度斯生物有限公司);細菌內(nèi)毒素工作標準品(批號為150601-201071，規(guī)格為90 EU/ 支，中國藥品生物制品檢定所)。Bioprobe—2002型細菌內(nèi)毒素測定儀，XW-80A型旋渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 細菌內(nèi)毒素限值(L)的確定 采用公式為：L=K/M，式中K為規(guī)定的給藥途徑，人每千克質(zhì)量每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5 EU/(kg.h);M為每千克質(zhì)量每小時的最大給藥劑量為30 IU/(kg.h)。計算得樣品的內(nèi)毒素限值L為0.167 EU/IU。

　　1.2.2 標準曲線制備及可靠性試驗 用細菌內(nèi)毒素檢查用水(BET)水1 mL溶解細菌內(nèi)毒素工作標準品，置漩渦混合器上混合15 min，然后逐級稀釋(每步不超過10倍)至最終細菌內(nèi)毒素濃度分別為2.00、0.25、0.03125 EU/mL,3個標準品溶液各取0.10 mL，分別加到預先加有0.10 mL動態(tài)濁度法鱟試劑的試管內(nèi)，混勻，立即插入Bioprobe—2002型細菌內(nèi)毒素測定儀內(nèi)，37℃1 h自動檢測，每個濃度重復3管，并同時做陰性對照2管。

　　1.2.3 干擾實驗

　　① 樣品最大稀釋倍數(shù)計算:公式為MVD=LC/λ1，式中λ1為動態(tài)濁度法標準曲線中最低點細菌內(nèi)毒素濃度0.03125 EU/mL;L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值0.167 EU/IU;C為10 IU/mL。計算得人凝血酶原復合物最大有效稀釋倍數(shù)MVD為53倍。

　?、?樣品溶液配制及干擾實驗:取人凝血酶原復合物樣品(批號為20110610，規(guī)格為300 IU/mL)用30 mL水復溶，然后用BET水稀釋為5、10、20、40、50倍溶液，作為樣品溶液，記為Ai液。同時進行同樣倍數(shù)稀釋，但在稀釋液中添加濃度為0.25 EU/mL或0.50 EU/mL的細菌內(nèi)毒素標準品，作為內(nèi)毒素陽性對照管，記為Bi液。分別吸取上述各液0.10 mL，加入預先加有0.10 mL動態(tài)濁度法鱟試劑(TAL)的試管內(nèi)混勻，立即插入Bioprobe—2002型細菌內(nèi)毒素測定儀內(nèi)自動檢測，每個濃度重復3管，計算回收率。回收率(%)=(Bi液內(nèi)毒素值-Ai液內(nèi)毒素值)/添加內(nèi)毒素濃度λ×100%。

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